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膠體金蛋白制備操作方法

1.肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白CElisa試劑盒待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。

2.待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0;標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.2;標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至7.6;標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.9~6.2;標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0;標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至9~10。

由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。

3.膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定

(1)根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。

(2)將標(biāo)記蛋白(以IgG為例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5mg/ml~50mg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。

(3)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。

(4)結(jié)果觀察，對(duì)照管(未加蛋白質(zhì))和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象;而加入蛋白量達(dá)到或超過zui低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的zui低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加10%~20%。

4.膠體金與蛋白質(zhì)(IgG)的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白CElisa試劑盒加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液終濃度為1%;1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/10。

5.膠體金標(biāo)記蛋白的純化

(1)超速離心法:根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。

用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金-羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心(20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min)20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4℃離心1h;20nm~40nm膠體金結(jié)合物，14 000g，4℃離心1h。仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3)，將沉淀重懸為原體積的1/10，4℃保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-18℃保存一年以上。

為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用10%~30%蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。

(2)凝膠過濾法:此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5~1/10。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝膠S-400)層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脫(內(nèi)含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG標(biāo)記物)，流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時(shí)略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白CElisa試劑盒隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，zui后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌、分裝,4℃保存。zui終可得到70%~80%的產(chǎn)量。

6.膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定

(1)膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量:用支持膜的鎳網(wǎng)(銅網(wǎng)也可)蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復(fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。

(2)膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定:膠體金顆粒在波長(zhǎng)510nm~550nm之間出現(xiàn)zui大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA，0.02%NaN3)將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋，OD520=0.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2~0.4。

(3)金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定:采用微孔濾膜免疫金銀染色法(MF-IGSSA)。將可溶性抗原(或抗體)吸附于載體上(濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜)，用膠體金標(biāo)記的抗體(或抗原)以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體，對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。

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