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（一）細胞表面分子交聯(lián)

    交聯(lián)劑常用于鑒定細胞表面受體和配體。不能通透細胞膜的水溶性交聯(lián)劑可以交聯(lián)細胞表面的相互作用蛋白，還可以降低膜的通透性和膜內(nèi)蛋白的反應(yīng)（Ji 197；WedekindF.1989）。

    磺酰基與NHS酯的琥珀酰亞胺酯環(huán)相連就得到了一種水溶性膜不通透的交聯(lián)劑，并且該種交聯(lián)劑不與膜內(nèi)蛋白發(fā)生反應(yīng)。所以，當(dāng)使用硫化NHS酯時，反應(yīng)時間和交聯(lián)劑用量都不是很重要的問題。同雙官能團、異雙官能團NHS酯和光反應(yīng)性芳香疊氮等交聯(lián)劑都是用于交聯(lián)細胞表面蛋白的合適選擇。

    使用水溶性及水不溶性交聯(lián)劑就可以判斷某一已知蛋白是定位于細胞膜表面還是定位于膜內(nèi)側(cè)。簡單說來，該策略的基本原理是，使用交聯(lián)劑處理細胞后，將交聯(lián)后的細胞蛋白經(jīng)PAGE膠分離，westernbloting鑒定。如果蛋白位于膜內(nèi)側(cè)，那么只有使用水不溶性交聯(lián)劑才會發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。如果蛋白位于細胞膜外表面，那么不管是使用水溶性還是水不溶性交聯(lián)劑都會發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。除了鑒定蛋白定位外，交聯(lián)劑還可以用于膜蛋白的放射性標(biāo)記。BASED是一種同雙官能團光反應(yīng)性交聯(lián)劑，常用于蛋白質(zhì)相互作用和結(jié)合的研究中。使用此種交聯(lián)劑就可以實現(xiàn)細胞表面蛋白的125I標(biāo)記。

（二）細胞膜結(jié)構(gòu)研究

    細胞膜結(jié)構(gòu)研究需要具有不同疏水性的試劑以確定細胞磷脂雙分子層中不同的蛋白、脂質(zhì)和其他分子的定位及其內(nèi)部環(huán)境。熒光標(biāo)簽可以確定細胞膜內(nèi)外的蛋白、脂質(zhì)和其他分子的定位。具有不同長度間臂的交聯(lián)劑可以用于交聯(lián)蛋白與相關(guān)分子來確定兩者之間的距離。使用短臂交聯(lián)劑成功交聯(lián)說明兩種分子以某種方式發(fā)生相互作用。如果使用了多種短臂交聯(lián)劑后都不能成功交聯(lián)，則使用長臂交聯(lián)劑。如果交聯(lián)成功這就說明兩分子可能位于膜內(nèi)的相同空間但是兩者沒有相互作用。同雙官能團NHS酯、亞氨酸酯或異雙官能團NHS酯/光活丙烯疊氮常由于此類反應(yīng)。雖然亞氨酸酯類交聯(lián)劑是水溶性的，但是它們?nèi)匀豢梢源┩?a href="http://www.hbzhan.com/st164341/list_716926.html">細胞膜。可與巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑也可以用于含有半的蛋白分子與其他分子的交聯(lián)反應(yīng)。

    EDC，水不溶性二環(huán)己基二碳亞胺DCC，和其他的水溶性或是水不溶性交聯(lián)試劑聯(lián)合使用，可以用于研究細胞膜和分子結(jié)構(gòu)、蛋白亞基結(jié)構(gòu)和排列、酶-底物相互作用和細胞表面與膜表面受體。相比DCC的高疏水性，EDC的親水性使其更適用于膜和亞基結(jié)構(gòu)研究。通常，的方式是聯(lián)合水溶性和水不溶性交聯(lián)劑以獲得蛋白-蛋白相互作用的完整空間信息。

（三）亞基交聯(lián)和蛋白結(jié)構(gòu)研究

    交聯(lián)劑還可以用于研究蛋白樣品的結(jié)構(gòu)和組成（HeymanandMen-tlein，1980）。某些蛋白比較難以研究是由于它們在不同pH值或鹽濃度條件下存在不同的構(gòu)象。使用交聯(lián)劑交聯(lián)蛋白分子中的亞基即可避免上述蛋白構(gòu)象的改變，便于研究蛋白的結(jié)構(gòu)和亞基組成。一般說來，可與氨基、羧基或是巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑都可以用于鑒定蛋白分子的亞基構(gòu)成及其之間的相互作用。并且，上述應(yīng)用中通常選擇短間臂或是中等長度間臂的交聯(lián)劑。碳二亞酰胺類交聯(lián)劑DFDNB和NHS-ASA是上述研究中常用的分子內(nèi)交聯(lián)劑，它們的合理使用可以避免與外源干擾蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。對于反應(yīng)條件而言，低濃度的蛋白樣品和高濃度的交聯(lián)劑都有助于保證反應(yīng)的特異性。

（四）蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)反應(yīng)

    分子生物學(xué)中經(jīng)常需要使用辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶或是某些熒光素分子標(biāo)記的抗體進行蛋白檢測。此外，抗原純化所需的親和介質(zhì)的制備也依賴于ProteinA/G與抗體分子之間的共價交聯(lián)。所以，交聯(lián)劑在抗體與蛋白分子的交聯(lián)反應(yīng)中有十分廣闊的應(yīng)用。許多交聯(lián)劑都可以用于抗體與蛋白分子之間的交聯(lián)反應(yīng)（Jackson1987）。戊二醛是以前比較常用的交聯(lián)劑，但是交聯(lián)物用于免疫反應(yīng)檢測時常出現(xiàn)較高的背景，所以目前較少使用。碳水化合物被氧化后可與伯氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，操作簡便，并且不會造成免疫檢測的背景升高，但是會出現(xiàn)抗體分子的自身交聯(lián)。NHS酯和亞氨酸酯類同雙官能團交聯(lián)劑雖然可以用于上述交聯(lián)反應(yīng)，但是也同樣存在聚合和自身交聯(lián)的問題。

    相比之下，異雙官能團交聯(lián)劑是用于蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的選擇（Nadeau，202）。這是因為使用異雙官能團交聯(lián)劑可以避免自身交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。目前常用的異雙官能團交聯(lián)劑有SMCC和Sulfo-SMCC。交聯(lián)劑DMP和DS可以用于抗體與ProteinA/GSepharose的交聯(lián)。此種方法制備的親和介質(zhì)可以用于純化抗原。抗體的Fc區(qū)可以結(jié)合ProteinA/G，F(xiàn)ab區(qū)可以特異性結(jié)合抗原。DS和DMP可以通過抗體和ProteinA/G的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而共價連接兩種蛋白。

（五）藥物與抗體交聯(lián)

    共價連接抗腫瘤藥和單克隆抗體可以使藥物導(dǎo)向腫瘤組織，提供腫瘤藥物治療的靶向性（Geofrey190）。對于大多數(shù)細胞藥物來說，它們的基團需要通過化學(xué)修飾轉(zhuǎn)化為更合適的功能基團才能與單抗連接。例如：羥基經(jīng)琥珀酰化很容易轉(zhuǎn)化為羧基，羧酸酯與肼反應(yīng)轉(zhuǎn)為酰肼。

    單抗有一定數(shù)目的反應(yīng)基團可用于與藥物交聯(lián)，它們中的一些用于維持抗體三級結(jié)構(gòu)，使其與抗原結(jié)合。對單抗廣泛的共價修飾會導(dǎo)致抗體可溶性和活性喪失，不同的單抗被修飾的可能程度不同。因此，一旦設(shè)計了一種合適的交聯(lián)方案，就有必要檢測抗體活性和蛋白質(zhì)被修飾后的恢復(fù)程度。目前，在單抗分子上引入反應(yīng)基團的方法有3種：用異雙功能交叉鏈，碳水化合物經(jīng)高碘酸鈉氧化形成醛基，二硫化物與 DTT反應(yīng)還原形成游離的巰基。

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